이 비디오는 vitronectin을 이용한 배양 플레이트 코팅 방법을 알려드려 새로 만들어진 iPSC 콜로니나 동결 배양액을 Essential 8™ Medium으로 옮길 수 있게 합니다. Essential 8™ Complete Medium을 사용하기 전에, vitronectin로 코팅된 플레이트를 준비해야 합니다. Vitronectin의 최적 작업 농도는 세포주마다 다르기 때문에 경험적으로 판단해야 합니다. 세포 표면 최종 코팅 농도 0.1--1.0 μg/cm2 범위에서 세포주에 따라 선택하길 권장합니다. 우리는 인간 PSC 배양에 vitronectin 0.5 μg/cm2을 많이 사용합니다. 배양 용기 코팅 전에 다음 공식을 이용해 vitronectin 작업 농도를 계산하고 원액(stock)을 적절히 희석합니다. vitronectin 제품 설명서에 필요한 배양 접시 표면적과 vitronectin 양이 목록으로 나와 있습니다. 예를 들어 6 웰 플레이트를 0.5 μg/cm2 농도로 코팅하려면 희석액 6mL를 준비해야 합니다(웰 표면적 10cm2, 웰 당 희석 vitronectin 1 mL). vitronectin을 수령하면 실온에서 바이알을 해동하고 폴리프로필렌 시험관에 60μL씩 분주합니다. 이를 --80°C에서 얼리거나 즉시 사용합니다. 6-웰 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 -80°C로 보관하고 있던 vitronectine 60μL를 꺼내 실온에서 해동합니다. 6-웰 플레이트당 60μL가 필요합니다. 해동한 vitronectin 60 μL를 실온에서 칼슘과 마그네슘이 없이 무균 DPBS 6mL가 들어있는 50-mL 원뿔형 시험관에 넣습니다. vitronectin 희석액을 피펫으로 위아래로 빨아오렸다 내렸다 하며 부드럽게 재현탁합니다. 이로 작업 농도 5 μg/mL, 즉 1:100 희석액이 만들어졌습니다. Add 1 mL of the 희석한 vitronectin 희석액 1mL를 6-웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 웰당 1mL로 6-웰 플레이트(10 cm2/well)를 코팅하여 최종 농도가 0.5 μg/cm2이 되게 합니다. 다른 종류의 배양 용기를 사용한다면 양에 대한 자세한 정보는 vitronectin 제품 설명서를 참조하십시오. 이렇게 코팅한 플레이트를 실온에서 1시간 배양합니다. 참고: 이 배양 용기는 이제 사용하거나 실험실 필름으로 감싸 2--8°C에서 보관합니다. 용기가 건조해지지 않게 하며 사용 전 배양 용기를 1시간 이상 실온에 두어 온도를 높입니다.

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